Với màn hóa thân xuất sắc thành Betty/Diane, sự nghiệp của Naomi Watts nhanh chóng vụt sáng lên một tầm cao mới.

Betty Elms (Naomi Watts) là tài năng mới nổi, chân ướt chân ráo đến Los Angeles. Cô được mô tả như người "lành mạnh, lạc quan, quyết tâm gây tiếng vang ở thành phố".[41] Ngoài ra, đây còn là nhân vật "ngây thơ đến lố bịch".[68] Cũng vì thế mà cách tiếp cận có phần dũng cảm, tự đắc của cô trước những điều sai trái để giúp Rita khiến nhiều người nhớ đến hình tượng thám tử Nancy Drew nổi tiếng.[68][69][70] Toàn bộ tính cách ban đầu của Betty rõ ràng mô phỏng lại kiểu nhân vật ngây thơ, nhẹ dạ ở vùng thôn quê. Tính cách đó của cô, hoặc ít ra có thể là phần đã mất của tính cách ấy đóng vai trò như trọng tâm trong Mulholland Drive. Theo nhà phê bình Amy Taubin, Betty là hiện thân cho phần ý thức lẫn vô thức của phim.[68] Chính Naomi Watts – người mà vai Betty của cô lấy cảm hứng từ các nhân vật gạo cội Doris Day, Tippi Hedren và Kim Novak – cũng thẳng thắn thừa nhận rằng Betty là kiểu nhân vật ưa chuộng cảm giác mạnh, một người "thấy mình ở một thế giới không thuộc về mình và sẵn sàng nhận lấy một danh phận mới, thậm chí nếu đó là của người khác".[29] Điều này đi đến kết luận rằng dù trong con người Betty vốn luôn tồn tại niềm ngây thơ, nhưng nỗi thiết tha đặt chân vào thế giới đầy cám dỗ của Hollywood đã biến cô thành một "diễn viên đồng lõa", chấp nhận "nắm lấy những kiến trúc làm nên thành công" mà sau này chính những kiến trúc ấy sẽ hủy diệt cô.[46] Trong một lời giải thích về sự phát triển của nhân vật Betty, Watts cho biết:

Do đó, tôi đã phải đưa ra quyết định của riêng mình liệu điều này có nghĩa là gì và nhân vật này đã trải qua điều gì, cái nào là mơ và cái nào là thực. Giải thích của tôi đến cuối cùng có thể hoàn toàn khác với David lẫn khán giả. Tuy nhiên, tôi chấp nhận tất cả điều đó, và mọi người đều nghĩ nó hợp lẽ.[71]

Trong phim, Betty tuy cảm thấy có phần khó tin trước nhân vật mà mình sẽ đảm trách nhưng vẫn thể hiện được chiều sâu đáng kinh ngạc trong buổi thử vai,[52][72] khác hẳn với buổi tập dượt thất bại trước đó với Rita tại căn hộ của mình.[41][72] Hôm thử vai, Betty mang nỗi lo âu cùng vẻ can trường vốn có, đi vào trong một căn phòng tù túng để đóng cảnh âu yếm nóng bỏng với người bạn diễn. Nỗi lo lắng trước đó bỗng chốc vụt đi đâu mất, nhường chỗ cho sự thăng hoa đến hoàn hảo trong phân cảnh khêu gợi tới mức cả khán phòng nín lặng. Phân cảnh kết thúc cũng là lúc mọi cảm xúc ùa về như cũ, cô ngại ngùng đứng trước mặt đoàn làm phim chờ đợi sự chấp thuận. Nhà phân tích phim Geogre Toles quả quyết rằng khả năng chưa từng được biết đến này của Betty đã chiếm trọn buổi trình diễn, thu hút tất cả những điều bí ẩn trong con người Rita và gán vào chính bản thân cô. Bằng cách sử dụng phân cảnh này, Lynch đã cho khán giả thấy rõ mánh khóe lừa gạt trong các tuyến nhân vật của mình.[72] Còn Ruth Perlmutter thì thắc mắc liệu kĩ năng diễn xuất của Betty lúc đó là một sự sắp xếp nhằm tái hiện lại hình ảnh chính cô ngoài đời thực – Diane, hay chỉ là một sự sao chép của bộ phim mà sau này diễn biến của nó chính là kết cục cho cuộc đời cô.[43]

Rita (Laura Elena Harring) là cô gái với bí ẩn, không nơi nương tựa, mẫu phụ nữ nguy hiểm với vẻ ngoài tăm tối nhưng hấp dẫn. Roger Ebert ấn tượng với Harring đến nỗi ông cho rằng "tất cả những gì cô ta phải làm là đứng đó và rồi cô ta sẽ là đề tài lý tưởng cho cuộc tranh luận về việc [có nên] làm lại phim Gilda sau 55 năm [hay không]".[69] Rita đóng vai trò như thế thân của dục vọng, trái ngược hoàn toàn với một Betty tươi sáng và tràn đầy tự tin. Cô cũng là nhân vật đầu tiên mà khán giả nhận định là kiểu người rối rắm, đáng sợ. Họ không thể biết được cô là ai cũng như cô sẽ đi về đâu. Hơn thế nữa, Rita còn là đại diện cho khao khát của khán giả nhằm thấu hiểu toàn bộ câu chuyện chỉ bằng cá tính độc nhất của riêng bản thân cô.[73] Thay vì đe dọa, Rita truyền cảm hứng khiến Betty tự nguyện cung dưỡng, an ủi và giúp đỡ mình. Việc bị mất trí nhớ khiến cho cô chỉ còn là một bản thể hoàn toàn trống rỗng, bản thể chứa đựng "vẻ đẹp khác thường cùng sự sẵn lòng của người xem trong việc đặt vào đó cả thảy ý niệm về thiên thần lẫn ác quỷ".[41] Một phân tích quả quyết rằng hành động của Rita là chân thực nhất trong phần đầu tiên của phim, vì cô bị mất trí nhớ và điều này có nghĩa không có gì có thể sử dụng để dựa vào đó làm khung tham chiếu cho cách ứng xử.[40] Tuy nhiên, Todd McGowan (tác giả của một quyển sách chuyên bàn về những chủ đề trong phim của Lynch) lại cho rằng phần đầu phim có thể cắt nghĩa thành tưởng tượng của Rita, cho đến khi nhân vật chủ chốt Diane Selwyn lộ diện. Về cơ bản, Betty là đối tượng để Rita xua đi mối băn khoăn về việc mất trí nhớ của mình.[74] Còn theo nhà sử học điện ảnh Steven Dillon, Diane đã chủ động chuyển đổi người bạn cùng phòng ngoài đời thực của mình thành Rita trong mơ. Cụ thể, sau cuộc cãi vã về việc người bạn kia muốn dọn nốt những đồ đạc còn sót lại của cô ra khỏi căn hộ, Rita bỗng nhiên xuất hiện ở đó và mỉm cười với Diane.[55]

Sau khi Betty và Rita tìm thấy cái xác bị phân hủy, họ bỏ chạy khỏi căn hộ. Ngay lúc đó, hình ảnh của họ bị tách ra và tái hòa nhập với nhau. David Roche lưu ý rằng việc Rita mất đi nhân dạng đã gây ra sự cố "không chỉ xảy ra ở cấp độ của nhân vật mà còn ở cấp độ của khung hình. Cảnh quay chứa nhiều hiệu ứng đặc biệt, âm thanh của các nhân vật bị làm méo và máy quay dường như đang cố tả lại trạng thái tinh thần của các nhân vật".[47] Rồi ngay tức thì, hai người trở về căn hộ của dì Betty nơi Rita đeo bộ tóc giả màu vàng (Rita có ý cải trang giống với Betty hòng khỏi bị nhận ra) nhưng vô tình lại khiến cô giống hệt Betty. Đây là sự chuyển giao mà một nhà phân tích từng gọi là "sự hòa tan của hai bản thể". Nhận định này có phần đúng bởi các manh mối trực quan lúc đó đã chỉ ra các góc máy ảnh dường như đã khiến cho khuôn mặt của Betty và Rita hợp nhất thành một. Điều này được minh họa rõ hơn bởi cảnh thân mật tình dục của hai người họ, tiếp theo sau là thời điểm tính cách của Rita bắt đầu trở nên chiếm ưu thế khi cô nhất định phải đến Club Silencio lúc 2 giờ sáng bằng bất cứ giá nào. Sự thống trị hoàn toàn của Camilla lúc này xem như không thể đảo ngược nữa.[53]

Diane Selwyn (Naomi Watts) là người phụ nữ thất vọng và chán nản, náu mình sau những vinh quang của Camilla, người mà cô thần tượng và ngưỡng mộ, nhưng lại không được đáp lại tình cảm. Diane là hiện thực "khó mà tin được" của Betty, hoặc là một phiên bản khác của Betty sau một thời gian dài sống ở Hollywood.[49] Đối với Steven Dillon, cốt truyện của bộ phim "biến Rita thành con tàu trống rỗng hoàn hảo cho những mộng tưởng của Diane", nhưng trớ trêu thay, Rita chỉ là "cái vỏ bọc vô tri vô giác" mà Diane "bỏ công sức trong vô vọng", dẫn đến việc cô suy sụp rồi tự kết liễu sau đó.[75] Bên cạnh đó, Diane còn là hiện thân cho sự bất thỏa mãn, được tỉ mỉ miêu tả khi cô thủ dâm nhưng không tài nào đạt cực khoái, khoảnh khắc mà "bằng sự xuẩn ngốc, mù quáng cùng đường của mình – không chỉ nước mắt và sự nhục nhã mà sự tan vỡ của giấc mơ cũng khao khát báo thù".[45] Một phân tích về Diane cho thấy sự tận tâm của cô dành cho Camilla dựa trên biểu hiện của lòng tự ái, vì Camilla là tất cả mọi thứ Diane muốn chiếm hữu.[76] Mặc dù Diane được miêu tả như một kẻ yếu đuối và thua cuộc, nhưng đối với Jeff Johnson (tác giả của một cuốn sách về đạo đức trong các bộ phim Lynch), Diane là nhân vật duy nhất trong phần sau phim mà các quy tắc về đạo đức vẫn còn nguyên vẹn. Cô ấy là "một người đàng hoàng bị tha hóa bởi những hành vi sai trái vốn cắm rễ rất sâu trong ngành công nghiệp điện ảnh".[77] Cảm giác tội lỗi và hối hận của cô thể hiện rõ trong vụ tự tử cùng những manh mối xuất hiện trong phần đầu tiên phim. Nỗi sợ hãi của Rita, xác chết cùng ảo ảnh tại nhà hát Club Silencio cho thấy có điều gì đó mờ ám và sai trái trong thế giới của Betty và Rita, nên khi tự do khỏi Camilla, những giá trị đạo đức vốn có đã thôi thúc cô kết liễu chính bản thân mình.[78]

Camilla Rhodes (Melissa George, Laura Elena Harring) chỉ cần khuôn mặt và cái tên là đã đủ khiến cho những kẻ có quyền lực gây sức ép buộc Adam phải tuyển mộ mình. Vai trò của cô không mấy ấn tượng ở phần đầu phim, thậm chí một nhà phê bình từng ví von nhân vật này giống một "con điếm nhạt nhẽo" hơn là diễn viên.[79] Tuy nhiên, khi chiếc hộp màu xanh được mở ra, Camilla trở lại là chính mình trong thế giới thực, cô lập tức biến thành một kẻ "phản trắc, phóng túng và đáng khinh bỉ".[41] Cô, người đàn bà với sự khêu gợi mãnh liệt, xuất hiện với mục đích "hút hết sinh khí của Diane", không ai khác, chính là nguồn cơn cho nỗi thất vọng tột độ của Diane.[64] Trong cuộc giao hợp ở phần sau phim, ngay khi vừa bảo Diane rằng cô ấy khiến mình hưng phấn tột độ, Camilla lại dìm người bạn tình xuống vực bằng việc buộc cô phải kết thúc mối quan hệ này. Ở một phân cảnh khác tại phim trường, nơi có mặt cả ba người: Adam, Camilla lẫn Diane, trong lúc Adam yêu cầu cả đoàn làm phim giải tán, để anh hướng dẫn một diễn viên nam "cách hôn Camilla sao cho đúng" thì chính cô lại bắt Diane ở lại chứng kiến. Màn tra tấn không thể tồi tệ hơn này cùng với hàng loạt phân cảnh sau đó đã đẩy Diane xuống vực thẳm không lối thoát, buộc cô gái đáng thương phải đưa ra lựa chọn tàn độc là giết chết người mình yêu. Có ý kiến cho rằng hình tượng Rita do Diane dựng nên chính là đại diện cho khao khát yếu đuối của cô đối với Camilla.[80]

Tài tử Justin Theroux trong vai vị đạo diễn cao ngạo Adam. Hình tượng của Adam không mấy thay đổi xuyên suốt diễn biến phim.

Adam Kesher (Justin Theroux) đầu phim được định hình như một kẻ "kiêu ngạo không rõ ràng".[81] Nhìn bề ngoài, Adam là một người thành đạt, nhưng sự nghiệp đạo diễn thì khá trắc trở, khi phải hứng chịu hết sự sỉ nhục này tới sỉ nhục khác. Theroux từng nói về vai trò của nhân vật này như sau: "Anh ta đại loại là kiểu nhân vật trong phim mà chẳng biết bất kì cái quái gì đang diễn ra cả. Tôi nghĩ anh ta là kiểu người mà khán giả hay nói 'Tôi khá giống anh bây giờ. Tôi không hiểu tại sao anh phải chịu nỗi đau như vậy'".[24] Sau khi bị tước mất vai trò sáng tạo trong phim, Adam còn chịu thêm một vố khác nữa khi cô vợ cắm sừng anh với một kẻ dọn bể bơi (Billy Ray Cyrus đóng) và tống anh ra khỏi căn biệt thự cao cấp trên đỉnh Hollywood. Không còn cách nào khác, Adam bèn tìm đến một nhà nghỉ rẻ tiền, nhưng dường như cả số phận cũng muốn trêu ngươi khi người quản lý khu nhà nghỉ thông báo thẻ tín dụng của anh ta bị hỏng. Trước mặt Diane, Adam lúc nào cũng thể hiện mình là một kẻ hào hoa, ra vẻ ta đây. Đây cũng là nhân vật mà tính cách dường như không bị ảnh hưởng bởi sự chuyển tiếp giữa mơ và thực trong hai phần của bộ phim.[82] Có ý kiến cho rằng việc Adam chọn Camilla thay cho Diane cho bộ phim trong phân cảnh ngoài thực tại đã ảnh hưởng đến quyết định giúp đỡ cũng như sự sẵn lòng của Betty với Rita trong mơ, khi cô nhận định những thảm kịch mà mình phải chịu đều do lỗi của những kẻ đại diện cho quyền lực mềm trong ngành điện ảnh.[53]

Các nhân vật nhỏ khác gồm có Gã Cao Bồi (Monty Montgomery), anh em nhà Castigliani (Dan Hedaya and Angelo Badalamenti) và Lão trùm Roque (Michael J. Anderson). Tất cả bọn họ, bằng cách nào đó đều nhúng tay vào việc gây áp lực buộc Adam phải tuyển mộ Camilla Rhodes cho bộ phim của mình. Những kẻ này đại diện cho cái chết của sự sáng tạo trong lĩnh vực điện ảnh,[76][83] cũng như phác họa một "góc nhìn khác của ngành công nghiệp nơi hệ thống thứ bậc và quyền lực ngầm chi phối tất cả".[68] Ann Miller vào vai dì Coco, bà chủ nhà trọ của Betty. Phần đầu phim, bà đại diện cho tầng lớp tinh hoa của Hollywood, những người luôn hoan nghênh, chào đón và bảo bọc những người như Betty. Trong phần sau của phim, bà đóng vai trò là mẹ của Adam, người quở trách Diane vì đến muộn, trêu chọc cô trong bữa ăn, thậm chí còn không đoái hoài tới việc Diane đang xấu hổ khi liên tục nhắc tới sự nghiệp diễn xuất không mấy tốt đẹp của cô trong quá khứ.[76]